［研究报告］苹果酵素对微囊藻的溶藻特征研究

基于环保酵素在中国的普及，相信针对环保酵素的研究报告会越来越多，环保酵素造福人民大众的愿望实现指日可待。感恩广大环保酵素爱好者、推广者的付出，更感恩各界人士的支持与理解。酵道孝道会一如既往地为普及环保酵素、健康养生而努力。

下面这个研究报告是针对治理河流富营养化的研究，转载分享给大家，为大家推广环保酵素助一臂之力。感恩大理学院作研究的师生、也感恩为我们提供资讯的王楠学长。

研究结论：该方法安全无毒，简单易做，溶解效率高，符合生态系统的规律，可以实现生态友好型控藻，将会是一种治理河流、湖泊富营养化的新型环保制剂。

环境与健康杂志2014年1月第31 卷第1期JEviron Heath,January 2014,Vo.31No.1
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·技术与方法
苹果酵素对微囊藻的溶藻特征研究
倪兆林1申元英12,王涛2艾志琼，杨冠英袁芝琼林丽佳1张义2
1.大理学院公共卫生学院云南大理 671000;2.大理学院基础医学院
摘要:目的，研究自制苹果酵素对微囊藻的溶解作用,并探讨其溶藻机制。方法在微囊藻藻液中加入不同体积03m不同稀释度0-10及经不同处理原液经0.22 m滤膜抽滤 2次、高温灭菌(121C01MPa灭菌20min以12000r/min 离心(离心半径3m 15 min0.25%的胰蛋白酶处理 15 mn的苹果素进行实验测定叶绿素a的含并计算清除率。结果随着加入苹果酵素量的增加,叶绿素 a 的清除率先升高后下降,在加入 0.6 ml 时除作用最强,4天的清除率达到最大,为 94.48%:随释倍数的增加,叶绿案的清除率先升高后下降,释 101倍时的清除离最强在第4天达最大为95.27%;经过不同处理的苹果酵素都能产生溶藻作用,第4天原液、经0.22m滤膜抽2次、高灭菌、以12000r/min离心(离心半径3cm)15 min0.2%的胰蛋白酶处理 15 min的叶绿素a清除率分别为 81.40%84.36%,80.18%,79.52%和 79.30%。结论该苹果酵素具有溶解微囊藻的作用,其溶机制为产生一种耐高温的非蛋白类物质间接作用溶藻。关键词:苹果酵素;微囊藻;溶藻机制文献标志码:A中图分类号:R123.3文章编号:1001-5914(2014)01-0057-03

NI Zhao-lin,SHEN Yuan-ying,WANC Tao,Al Zhi-qiong,YANC Guan-ying,YUAN Zhi-qiong,LIN Li-jia,ZHANC YiCollegle of Public Health ,Dali University ,Dali,Yunnan 671000.Chino
Corresponding author:SHEN Yuan-ying,E-mailyuanyingshen@163.cor
Abstract:ObiectiveTo study the algicidal effect of homemade apple enzyme to Microcystis,and discuss the algicidamechanism. Methods The content of chlorophyl-a and the clearance rate were determined on adding apple enzyme with theyolume from 0 to 3 ml, the dilution of 0 to 10 * times, and diferent processing the stoste, the stoste needs to be collated twicethrough the filter of 0.22 um, high-temperature sterlization (121 ,0.1 MPa,20 minutes), centrifugation of 15 minutes with12 000 r/min (r-3 cml. and 025% trypsin treatment for 15 minutes in Microcystis . Results With the increasing of applwas maximum when added 0.6 ml applenzyme the clearance of chlorophyll-a increased and then decreasecand the function ?enzyme into the fluid of Microcystis, the clearance of chlorophyll-a reached 94.475% at the fourth day. The apple enzyme wasdiluted with distilled water, and the clearance of chlorophyll-ad and then decreased with the increasing dilutiormultiple.when it was diluted by 10- times. the clearance of chlorophyll-a reached 95.27% at the fourth day. lhe clearance othese diferent treatments at the fourth day was as follows: 8140% for stoste, 84.36% for twice fltration by 0.22 um filter80.18% for high-temperature sterlization (121 C,0.1 MPa,20 minutes), 79.52% for 15-minute centrifugation with 12 000r/min(r-3 cm), 79.30% for 15- minute treatment with 0.25% trypsin. Conclusion The apple enzyme used in the study haeffect on algicidal Microcystis, the algicidal mechanism is indirect action by producing a high temperature resistance ononprotein substance.Key words:Apple enzyme ;Microcystis ;Algicidal mechanism
水体的富营养化污染不仅破坏了水生生态系统的平衡,而且产生有毒有害的藻类(蓝藻、甲藻、硅藻异弯藻等)引起水华或赤潮，释放有毒物质叫,对公众健康、牲畜和水源供给带来负面影响，甚至严重危害生态安全2。因此,寻找合理有效的水华藻类防治方法迫在眉睫。环保酵素技术是泰国乐素昆·普潘翁博士
基金项目:国家科技重大专项么X07105-004-001-002:云南省教育厅学研究基金(2012J049;2013 年度大理市科技局科研计划项目;大理学院洱海保护研究专项课题KYRH201005作者简介:倪兆林(1987-)男硕研究生，从事流行病与卫生统计学研究。通讯作者:中元英E-mail:yuanyingshen@163com
经过30多年努力所研发的一种果皮蔬菜厨余酵素是对混合了糖和水的厨房鲜垃圾经过厌氧发酵后产生的棕色液体的通俗称法。环保酵素的生产过程并不使用任何化学合成物质,在酿制过程中，互相促进，共同构成一个复杂而稳定的具有多元功能的酵素生态系统，可抑制有害微生物(尤其是病原微生物和腐败细菌的活动，具有促进植物生长、净化水流等作用然而国内外尚未见环保酵素在湖泊富营养化中应用的文献报道。因此，本研究初步探讨了苹果酵素对微囊藻的作用特征及其作用机制,以期为苹果酵素在环境治理中的应用提供理论依

1材料与方
1.1材料
1.1.1藻种及其培养条件实验藻种为 2011年7月大理洱海蓝藻暴发期间分离纯化。藻种经活化后，于25C、2级光照光暗比 12 h/12h 条件下,采用藻通用BG11培养基在光照培养箱中预培养 3~7d,备用。1.1.2苹果酵素的制备将红糖、苹果水按1kg3kg:10L混合后发酵5个月,得到果酵素,备用。1.13仪器与试剂LC-300光照培养箱(中国广州康恒仪器有限公司)SW-CJ-2FD 洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，JA1203N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)YXO-LS-50S11立式压力蒸气灭器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，TGL-16G 菲恰尔台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)PowerwaveXS 连续波长酶标仪(上海博迅实业有限公司医疗设备厂。丙酮(AR,云南汕滇药业有限公司)1.2方法
1.2.1 叶绿素a(Chla含量的测定4-5] 每天定时取1ml待测藻液,以4000r/min 离心(离心半径为3cm10min,弃去上清液,加入等体积90%(V/的丙酮，合均匀,将混匀的液体于4C、黑暗条件下抽提 24 h再以4000r/min 离心(离心半径为 3cm 10min,取上清用连续波长酶标仪分别测定 665649nm处的吸光度 ()值,并计算叶绿素 a(ug/m) 的含量(叶绿素 a含量=13.7×46-5.76A;以叶绿素a的清除率表征溶藻效果，叶绿素 a 的清除率=(初始溶液中叶绿素a含量-反应后溶液中叶绿素 a含量)/初始时溶液中叶绿素a含量x100%。

1.2.2加入不同体积的苹果酵素对微囊藻的溶解作用分别取30 ml初始叶绿素a为1.121 ug/ml 的微囊藻藻液于100ml三角烧瓶中，再依次加入0(对照、0.1、0.3、0.50.6123 ml的苹果酵素进行溶漠实验,培养条件同“1.1.1”每天定时取样测定叶绿素 a的含量变化,连续观察 4d。每组做 3 个平行。1.2.3将苹果酵素稀释后对微囊藻的溶解作用将苹果酵素用灭菌蒸馏水梯度稀释[0(原液10110210-1010分别取不同梯度的稀释液各 3 ml,分别加入30ml初始叶绿素a为1121ug/ml的微赛藻藻液中进行溶藻实验，空白组加入 3 m 蒸馏水，每个样度设立3个平行，培养条件同“1.1.1”每天定时取样测定叶绿素 a的含量变化,连续观察 4d。
124苹果酵素的溶藻方式分别取原液经0.22m滤膜抽滤2次高温灭菌(121C.1MPa灭菌20min以12 000 r/min 离心(离心半径为3 cm15 min0.25%胰蛋白酶处理15min的苹果酵素3ml，分别加入30ml初始叶绿素a为 1121 ug/ml 的微囊藻藻浓中进行溶藻实验，空白组加入 3 ml蒸留水，每组设3个平行,培养条件同“1.1.1”,每天定时取样测定叶绿素a的含量,连续观察4d。
2结果与讨论
21 加入不同体积的苹果酵素对微囊菜的溶解效果与对照组相比，随加入苹果酵素量的增加，叶绿素 a的含量先下降后上升,尤其在加入0.6ml时叶绿素a含量下降较大,且第4 天叶绿素a的清除率最大(为94.48%而加入0.1ml苹果酵素组的叶绿素a含量没有下降说明苹果酵素在该浓度下无溶藻作用，见表1.

22将苹果酵素稀释后对微靠禁的溶解效果随着苹果酵素稀释度的增加，叶绿素a的含量先下降后升高，尤以稀释 10-倍的叶绿素a含量下降最大,到第4天苹果酵素的除藻率达到最大(为 95.27%。这与有关溶藻细菌的溶藻作用报道结果167一致，稀释度对溶漠效果有影响。见表 2。

2.3苹果酵素的溶藻方式细菌的溶藻方式主要包括直接接触溶藻和间接接触溶藻:其中，间接接触溶藻又可释放特异性或非特异性的胞外物质抑制和溶解藻细胞包括通过释放蛋白质、氨基酸、释胺、含贫化合物、多肤类和抗生素等杀藻物质18%。
本研究结果显示，加入不同处理的苹果酵素后与对照组相比，经0.22um滤膜抽滤2次高温灭菌以12000r/min 离心(离心半径为3cm 15min 025%胰蛋白酶处理 15min的藻液颜色变黄,几乎看不到绿色藻颗粒物质，叶绿素a含量下降。苹果酵素经过0.22um 滤膜过滤和高速离心后仍然具有溶藻作用

说明该苹果酵素产生了一种特殊物质间接作用于藻颗粒，而且经过高温处理和 0.25%的胰蛋白酶处理后仍然能溶解藻颗粒，说明该苹果酵素产生溶藻作用的物质具有很强的热稳定性,且不属于蛋白质类。见表3